В 1966 году стал стипендиатом Йельского университета. В ходе президентской кампании 1964 года был членом избирательного штаба республиканца-антикоммуниста Барри Голдуотера, который объявлял о намерении сбросить атомную бомбу на Вьетнам.

В 1981 году начал работу в администрации Рональда Рейгана как генеральный юрисконсульт, а в 1982 году продвинулся до заместителя администратора программного и стратегического планирования в Агентстве США по международному развитию (USAID). В 1984 году был исполнительным директором Комитета по разработке избирательной платформы республиканцев на очередных президентских выборах.

В 1985-1989 годах — заместитель министра юстиции в администрации Рональда Рейгана, занимался кадровыми вопросами в юридической системе США.

В 1989-1993 годах в администрации Джорджа Буша-старшего занимал должность помощника государственного секретаря по делам международных организаций.

После поражения Буша-старшего на выборах в 1992 году Болтон вернулся к юридической практике, став партнером фирмы Lerner, Reed, Bolton & McManus. Критиковал администрацию Билла Клинтона за решение о присоединении США к Международному уголовному суду.

В ходе президентских выборов 2000 года, на которых Джордж Буш-младший с минимальным отрывом одержал победу над демократом Альбертом Гором, Болтон был участником скандального пересчета голосов в штате Флорида. Сразу после этого в администрации Буша-младшего получил пост заместителя госсекретаря по контролю над вооружениями и международной безопасности.

Большинство экспертов считает Болтона «ястребом» и сторонником расширения американского военного и политического влияния в мире. Он приверженец жесткой линии по отношению к КНДР, Ирану, Кубе и России. В 2002 году добился отмены ратификации США статута МУС. В 2003 году — ярый сторонник вторжения США в Ирак. До сих пор считает, что военное вмешательство было необходимым.

В августе 2005 года Джона Болтона назначают на пост постоянного представителя США при ООН. Против этого решения выступали и демократы, и часть республиканцев, поэтому Буш-младший назначил Болтона в период парламентских каникул.

На новом посту Болтон не скрывал своего негативного отношения к ООН, заявляя, что данной организации не существует, а все страны должны идти за США. Осознавая, что Болтон не будет утвержден Сенатом на должности постпреда при ООН, в декабре 2006 года Буш отправил его в отставку.

В 2007 году Болтон в качестве старшего научного сотрудника приходит в Американский институт предпринимательства. В 2012 году становится советником по внешней политике кандидата в президенты республиканца Митта Ромни. Сотрудничает с рядом консервативных общественных организаций и аналитических центров.

2 марта 2018 года президент США Дональд Трамп объявил об отставке своего помощника по национальной безопасности Герберта Макмастера. 9 апреля его сменил Джон Болтон. Как сообщает CNN со ссылкой на источник в Белом доме, в ходе встречи Дональда Трампа с Болтоном, предшествовавшей его назначению, он пообещал президенту, что «не начнет никаких войн» в новой должности.