В 1984 году с отличием окончила экономический факультет Днепропетровского университета. Специальность — экономист. Кандидат экономических наук, диссертацию на тему «Государственное регулирование налоговой системы» защитила в 1999 году в Киевском национальном университете.
По окончании университета с 1984 по 1988 год работала инженером-экономистом на Днепропетровском машиностроительном заводе им. Ленина.

В 1988 году вместе с мужем Александром Тимошенко открыла видеосалон.

В 1989-1991 гг. Юлия Тимошенко — коммерческий директор молодежного центра «Терминал».

В 1991-1995 гг. — коммерческий, а затем генеральный директор корпорации «Украинский бензин» (КУБ), которая занимается торговлей горюче-смазочными материалами.

С ноября 1995 года по 1997 год Тимошенко — президент финансово-промышленной корпорации «Единые энергетические системы Украины» (ЕЭСУ); после отставки в июле 1997 года премьер-министра Павла Лазаренко потеряла свой пост.

В 1997-1999 гг. Юлия Тимошенко — депутат Верховной Рады от объединения «Громада». С 1998 г. — председатель бюджетного комитета Верховной Рады.

В 1999 г. она основала новую политическую партию — Всеукраинское объединение «Батькивщина», став ее председателем и руководителем фракции «Батькивщины» в Верховной Раде.

С декабря 1999 по 19 января 2001 года Юлия Тимошенко — вице-премьер Украины по проблемам топливно-энергетического комплекса. Председатель правительственного комитета по реформированию ТЭК. Автор «Энергетической концепции Украины».

После возбуждения против нее уголовного дела Генеральной прокуратурой Украины была отправлена в отставку. В феврале 2001 году она была арестована по обвинению в хищении (в бытность главой ЕЭСУ) 1 млрд долларов, предназначенного на оплату российского газа. В марте 2001 г. Печерский районный суд Киева признал беспочвенность выдвинутых обвинений и санкцию на арест отменил, сообщает РИА Новости.

В 2001 году Юлия Тимошенко стала инициатором создания, а затем и лидером Форума национального спасения (ФНС) — общественного объединения, которое состояло из нескольких оппозиционных партий. В ноябре 2001 года ФНС был переименован в Блок Юлии Тимошенко (БЮТ). Во главе БЮТ в марте 2002 года Тимошенко пошла на парламентские выборы. По результатам выборов БЮТ получил в Верховной Раде более 20 мест.

С 14 марта 2002 по 4 февраля 2005 года — народный депутат Верховной Рады Украины.

В 2004 г. БЮТ и блок «Наша Украина» создают коалицию «Сила народа» для поддержки кандидатуры Виктора Ющенко на выборах президента Украины. В ноябре-декабре 2004 года Юлия Тимошенко становится одним из лидеров «оранжевой революции».

С 24 января по 4 февраля 2005 года она исполняла обязанности премьер-министра Украины.

С 4 февраля по 8 сентября 2005 года — премьер-министр Украины. 8 сентября 2005 г. правительство Юлии Тимошенко было отправлено в отставку.

На парламентских выборах 26 марта 2006 г. Блок Юлии Тимошенко получил 129 депутатских мандатов из 450. Попытка Юлии Тимошенко воссоздать оранжевую правительственную коалицию (БЮТ — Наша Украина — СПУ) и вновь занять пост премьер-министра закончилась неудачей. Потерпев поражение, она заявила о переходе в жёсткую оппозицию.

На внеочередных выборах в Верховную Раду 30 сентября 2007 года БЮТ набрал 30,71% голосов, и после создания «оранжевой коалиции» с блоком «Наша Украина — Народная самооборона» (НУНС) получил парламентское большинство.

18 декабря 2007 года Юлия Тимошенко была избрана премьер-министром Украины.

В начале 2010 года Юлия Тимошенко баллотировалась на пост президента Украины. По итогам второго тура голосования, состоявшегося 7 февраля 2010 года, она проиграла Виктору Януковичу с разрывом в 3,48%. Юлия Тимошенко набрала 45,47% голосов избирателей, а ее соперник Виктор Янукович — 48,95%.
3 марта 2010 г. парламент Украины отправил в отставку правительство во главе с Юлией Тимошенко.

После отставки Тимошенко объявила о переходе в оппозицию.

В 2011 году Тимошенко была осуждена на 7 лет лишения свободы за превышение должностных полномочий при заключении газового контракта с РФ в 2009 году. Освобождена после победы «евромайдана».

Участвовала во внеочередных президентских выборах в 2014 году. По итогам выборов Петр Порошенко победил в первом туре, за Юлию Тимошенко, занявшую второе место, проголосовали 12,81 % (2 309 812) избирателей.

На парламентских выборах 2014 года Юлия Тимошенко избрана народным депутатом Украины по списку партии «Батькивщина».

Тимошенко заявляет, что находится в жесткой оппозиции к «олигархическому режиму Порошенко».

Является одним из наиболее вероятных претендентов на победу в будущих президентских выборах. Как следует из результатов опроса Киевского международного института социологии (КМИС), если бы выборы президента на Украине состоялись в июне 2018 года, на них победила бы Юлия Тимошенко, за которую готовы проголосовать 22,8% опрошенных (за действующего президента Петра Порошенко — только 10,5%).

Юлия Тимошенко практически уже начала президентскую кампанию, презентовав на конференции в Киеве стратегическую программу «Новый курс Украины», в котором предлагается фактически «переосновать государство Украина» и изменить систему государственного управления.